lipo2000使用说明书及Lipo2000多久换液详解精选6篇

Lipo2000使用时需注意操作步骤，定期更换液体以确保效果，具体更换周期依据使用频率而定，如何判断最佳时机呢？以下是网友为大家整理分享的“lipo2000使用说明书及Lipo2000多久换液详解”相关范文，供您参考学习！

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文章目录 篇2

lipo2000使用说明书

Lipo2000多久换液

lipo2000需要无血清转染吗

lipo2000需要无血清转染吗 篇3

这是一个非常经典且重要的问题，答案并不是简单的“是”或“否”，而是在转染过程的不同步骤中有不同的要求。

核心结论

一句话总结：在“制备转染复合物”的步骤中【必须】使用无血清培养基，但在将复合物加入细胞进行转染时，细胞可以培养在【含有血清】的完全培养基中。

下面我们分点详细解释。

1. 为什么“制备复合物”时必须无血清？

这是整个转染实验成功的关键。

• 作用原理：Lipofectamine 2000是一种阳离子脂质体。它的带正电荷的头部会与核酸（DNA质粒或siRNA）分子上带负电荷的磷酸骨架通过静电作用结合，将核酸包裹起来，形成“脂质体-核酸复合物”。这个复合物整体带正电，容易与带负电的细胞膜结合，从而通过内吞作用进入细胞。
• 血清的干扰：血清（如FBS）中含有大量的蛋白质（如白蛋白）、生长因子和其他大分子，其中许多都带有负电荷。
  • 如果在稀释Lipo2000或核酸时，或者在将它们混合形成复合物时，培养基中存在血清，那么血清中带负电的蛋白就会与带正电的Lipo2000发生竞争性结合。
  • 这种竞争会严重阻碍Lipo2000与核酸的有效结合，无法形成结构完整、电荷正确的转染复合物。
  • 最终结果就是转染效率急剧下降甚至失败。

因此，稀释Lipo2000和核酸，以及混合孵育形成复合物的这5-20分钟，必须在无血清、无抗生素的培养基（如Opti-MEM I）中进行。

2. 为什么“转染细胞”时可以有血清？

这是Lipofectamine 2000相比于早期转染试剂（如Lipofectamine初代）的一个巨大优势。

• 复合物的稳定性：一旦“Lipo2000-核酸复合物”在无血清环境中成功形成，它的结构就相对稳定了。此时再将其加入到含有血清的细胞培养基中，血清蛋白对其的破坏作用会大大减小。
• 维持细胞健康：在含有血清的完全培养基中进行转染，对细胞有两大好处：
  1. 降低细胞毒性：Lipo2000本身对细胞有一定毒性。血清的存在可以中和一部分游离的Lipo2000，从而减轻其对细胞的毒性作用，保护细胞。
  2. 提供营养：血清中的生长因子和营养物质能让细胞在转染这个“应激过程”中保持更好的生理状态和活力，有利于后续的基因表达。

3. 标准操作步骤分解（血清使用视角）

步骤	操作内容	是否需要无血清？	关键说明
1. 稀释核酸	将DNA或siRNA用无血清培养基（推荐Opti-MEM I）稀释。	是 (必须)	确保没有血清蛋白干扰。
2. 稀释Lipo2000	将Lipo2000用无血清培养基（推荐Opti-MEM I）稀释。	是 (必须)	同上，避免Lipo2000失活。
3. 制备复合物	将稀释好的核酸与稀释好的Lipo2000混合，室温孵育5-20分钟。	是 (必须)	这是形成有效转染复合物的关键一步。
4. 加入细胞	将孵育好的复合物混合液逐滴加入到培养皿的细胞中。	否 (可以含血清)	此时细胞可以（也推荐）培养在含有10%血清的正常完全培养基中。
5. 转染后培养	将细胞放回培养箱继续培养4-6小时或更长时间。	否 (可以含血清)	4-6小时后，可以选择更换为新鲜的完全培养基，以进一步去除残留的Lipo2000，降低毒性。对于一些敏感细胞，这一步是必要的。对于皮实的细胞，不换液也可以。

4. 总结与最佳实践建议

1. 首选稀释液：强烈推荐使用Opti-MEM I Reduced Serum Medium作为稀释Lipo2000和核酸的培养基。它经过优化，能显著增强脂质体介导的转染效率，效果优于普通的无血清DMEM等基础培养基。
2. 抗生素问题：在稀释和制备复合物的步骤中，不要使用含有抗生素（如青霉素-链霉素）的培养基。虽然干扰不如血清严重，但抗生素可能增加对细胞的压力和毒性，影响转染效果。在将复合物加入细胞时，培养基中可以含有抗生素。
3. 关注细胞毒性：如果转染后发现大量细胞死亡、漂浮或形态变差，应考虑：
   • 降低Lipo2000和/或核酸的用量。
   • 缩短复合物与细胞的共孵育时间（例如，4小时后准时换液）。
   • 确保转染时细胞密度在合适的范围（通常建议70%-90%汇合度）。

总而言之，使用Lipofectamine 2000进行转染的关键在于“复合物制备”这一步必须在无血清培养基中进行，而“将复合物加入细胞”以及后续培养则可以在含血清的培养基中进行。这既保证了高转染效率，又维持了细胞的健康状态。

资源展示如下 篇4

lipo2000使用说明书 篇5

一、 产品简介与核心原理

• 产品名称: Lipofectamine™ 2000 Reagent
• 用途: 用于将核酸（如质粒DNA、siRNA、miRNA）高效导入多种真核细胞系的高性能阳离子脂质体转染试剂。
• 核心原理: Lipo2000是一种多组分的阳离子脂质体制剂。其带正电荷的脂质体可以与带负电荷的核酸分子（DNA/RNA）自发结合，形成“脂质体-核酸复合物”。该复合物能够与带负电的细胞膜融合，通过内吞作用进入细胞，最终在细胞内释放核酸，从而实现基因的表达或沉默。
• 主要优点:
  • 高转染效率: 对多种常见和难转染的细胞系都表现出优异的性能。
  • 适用性广: 可用于DNA和RNA的共转染。
  • 操作简便: 流程快速，通常在15-30分钟内即可完成复合物的制备。
  • 血清兼容: 形成的复合物在含有血清的培养基中依然稳定，转染时无需更换或去除血清（尽管在无血清条件下孵育复合物效果更佳）。

二、 实验前准备

1. 细胞准备:
   • 在转染前一天，将细胞传代接种到培养板中。
   • 确保在转染当天，细胞状态良好，处于对数生长期。
   • 细胞密度（汇合度）对于转染效率至关重要，推荐的汇合度为70-90%。密度过低或过高都会影响效率。
2. 核酸准备:
   • 确保质粒DNA或siRNA具有高纯度（A260/A280 ≈ ；A260/A230 > ），无内毒素、RNA或蛋白质污染。
   • 将核酸稀释于无菌水或TE缓冲液中，备用。
3. 试剂准备:
   • Lipofectamine™ 2000: 使用前需恢复至室温，并轻轻混匀（严禁涡旋震荡，只能轻柔颠倒混匀或用指尖轻弹）。
   • 稀释液:必须使用无血清、无抗生素的培养基进行稀释，强烈推荐使用Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium，它能显著提高转染效率。如果没有，可以使用DMEM等基础培养基，但不能含有血清或抗生素。

三、 标准转染流程（以24孔板为例）

以下流程是标准方案，具体用量需根据细胞类型和实验目的进行优化。

第1步：细胞铺板

• 转染前24小时，将约 5 x 10⁴ – 2 x 10⁵ 个细胞/孔 接种到24孔板中，加入500 μL含血清的完全培养基。
• 确保转染时细胞汇合度达到70-90%。

第2步：制备转染复合物（室温操作）

• 管A (稀释DNA):
  • 取一个无菌EP管。
  • 将μg质粒DNA加入到50 μLOpti-MEM™ I 培养基中。
  • 轻轻混匀（用移液器吹打或指尖轻弹）。
• 管B (稀释Lipo2000):
  • 取另一个无菌EP管。
  • 将– μLLipofectamine™ 2000 试剂加入到50 μLOpti-MEM™ I 培养基中。
  • 轻轻混匀，并在室温下孵育5分钟。（注意：Lipo2000稀释后必须在30分钟内使用）。
• 混合与孵育:
  • 将管A（稀释的DNA）的全部液体加入到管B（稀释的Lipo2000）中。
  • 轻轻混匀，室温孵育 10-20 分钟。此步骤是形成脂质体-核酸复合物的关键。此时溶液可能会变得稍微浑浊，属于正常现象。

第3步：转染细胞

• 将100 μL转染复合物逐滴、均匀地加入到含有细胞和500 μL完全培养基的24孔板的孔中。
• 轻轻地前后左右晃动培养板，以确保复合物分布均匀。
• 无需更换培养基，因为Lipo2000复合物在血清存在下依然有效。

第4步：转染后培养与检测

• 将培养板放回37°C、5% CO₂的培养箱中培养。
• 对于有细胞毒性的情况: 可以在加入复合物后4-6小时更换为新鲜的完全培养基，以降低毒性。对于大多数细胞，此步骤非必需。
• 在转染后24-72小时进行后续检测（如荧光观察、Western Blot、qPCR等）。

四、 不同培养板规格的推荐用量表

培养容器	表面积	铺板体积	DNA用量	Lipo2000用量	稀释液体积
96孔板	cm²	100 μL	µg	µL	2 x 25 μL
24孔板	cm²	500 μL	µg	µL	2 x 50 μL
12孔板	cm²	1 mL	µg	µL	2 x 100 μL
6孔板	cm²	2 mL	µg	4-10 µL	2 x 250 μL
10cm皿	58 cm²	10 mL	8-15 µg	20-30 µL	2 x mL

• 稀释液体积: 指的是DNA和Lipo2000分别使用的稀释液体积。例如，24孔板用“2 x 50 μL”表示DNA用50 μL稀释，Lipo2000也用50 μL稀释。
• Lipo2000用量: 提供了一个范围，建议从中间值开始尝试，然后根据细胞毒性和转染效率进行优化。

五、 优化指南

没有一种方案适用于所有细胞。为获得最佳结果，请在以下方面进行优化：

1. 细胞密度: 70-90%的汇合度是最佳起点。
2. Lipo2000与DNA的比例: 这是最关键的优化参数。通常，DNA（µg）与Lipo2000（µL）的比例在1:1 到 1:3之间。
   • 对于敏感细胞，使用较低的Lipo2000比例（如1:1或1:2）以减少毒性。
   • 对于难转染细胞，可尝试较高的比例（如1:3）。
3. DNA和Lipo2000的绝对量: 如果细胞毒性大，可以同时降低DNA和Lipo2000的用量，同时保持最佳比例。反之，如果效率低且无毒性，可适当增加用量。
4. 培养时间: 转染后细胞的培养时间（24h, 48h, 72h）会影响蛋白表达水平，需根据实验目的确定最佳检测时间点。
5. 更换培养基: 如果细胞对转染复合物敏感，出现大量死亡或状态不佳，可在转染4-6小时后更换为新鲜的完全培养基。

六、 常见问题与故障排除 (FAQ)

• 问题1：转染效率低
  • 可能原因:
    1. Lipo2000与DNA比例不佳（最常见）。
    2. 细胞状态差、代数过高或密度不合适。
    3. DNA质量差（纯度低、有污染）。
    4. Lipo2000失效（反复冻融或剧烈震荡）。
    5. 稀释液中含有血清或抗生素。
    6. 复合物孵育时间不足或过长。
  • 解决方案:
    1. 优化Lipo2000与DNA的比例（例如，固定DNA为µg，测试Lipo2000用量为, , µL）。
    2. 使用状态良好的对数期细胞。
    3. 重新提取或纯化DNA。
    4. 使用Opti-MEM™进行稀释。
• 问题2：细胞毒性大，大量死亡
  • 可能原因:
    1. Lipo2000或DNA用量过高。
    2. 细胞对转染试剂本身敏感。
    3. 转染复合物在细胞上孵育时间过长。
    4. 细胞密度过低，导致单个细胞接触的复合物过多。
  • 解决方案:
    1. 降低Lipo2000和/或DNA的用量。
    2. 确保细胞铺板密度不低于70%。
    3. 在转染后4-6小时更换新鲜培养基。
    4. 如果细胞非常敏感，可考虑换用更温和的转染试剂（如Lipofectamine™ 3000）。
• 问题3：实验重复性差
  • 可能原因:
    1. 每次实验的细胞密度、状态不一致。
    2. 移液操作不精确。
    3. Lipo2000试剂没有充分混匀。
  • 解决方案:
    1. 严格控制细胞铺板数量和培养时间。
    2. 确保移液器校准准确。
    3. 每次使用前，将Lipo2000恢复至室温并轻柔颠倒混匀。

Lipo2000多久换液 篇6

一、核心答案：标准换液时间

通常建议在转染开始后的 4-6 小时更换培养基。

这是一个在保证转染效率和降低细胞毒性之间取得的最佳平衡点。

• 少于4小时：Lipo2000-核酸复合物可能还没有足够的时间进入细胞，导致转染效率偏低。
• 超过6小时：Lipo2000对大多数细胞都有明显的毒性，长时间孵育会导致大量细胞死亡、状态变差，影响后续实验结果。

二、为什么必须在这个时间点换液？

换液的主要目的有两个：

1. 移除有毒的转染复合物：
   • Lipo2000是一种阳离子脂质体，它通过与带负电的细胞膜融合来递送核酸。这个过程本身对细胞膜是一种损伤。
   • 残留在培养基中以及未进入细胞的Lipo2000-核酸复合物对细胞具有持续的毒性作用。及时移除它们是保证细胞健康存活的关键。
2. 为细胞提供正常的生长环境：
   • 为了达到最高的转染效率，Lipo2000的说明书通常建议在无血清或低血清的培养基（如Opti-MEM）中进行转染。
   • 血清中的某些蛋白会干扰Lipo2000与核酸的结合，并可能降低其与细胞膜的融合效率。
   • 然而，细胞不能长时间在无血清/低血清的环境中生长。4-6小时后，需要换回含有血清和足够营养的完全培养基，让细胞恢复正常生长和表达目的基因。

三、详细的时间线和操作流程

假设你今天要进行一次细胞转染实验，整个流程中的换液环节如下：

时间点 (T)	操作步骤	目的与注意事项
T = 0 小时	1. 吸掉细胞培养板中原有的旧培养基。 2. 将Lipo2000-核酸复合物（已在Opti-MEM中孵育好）加入到细胞孔中。	开始转染。 • 确保加入的液体体积能完全覆盖细胞层。 • 轻轻地沿孔壁加入，避免冲散细胞。
T = 4-6 小时	1.（关键步骤）小心吸走含有转染复合物的培养基。 2.（可选，但推荐）用预热的无菌PBS轻轻清洗细胞1次。 3. 加入预热至37°C的正常完全培养基（含血清和双抗）。	结束转染，开始恢复培养。 •操作一定要轻柔，防止贴壁细胞脱落。 • PBS清洗可以更彻底地移除残留的复合物，对敏感细胞尤其重要。 • 使用预热的培养基，避免对细胞造成温度刺激。
T = 24-72 小时	正常培养，期间可根据需要更换新的完全培养基。	收获细胞或检测结果。 •检测蛋白表达 (Western Blot)：通常在转染后48-72小时。 •检测mRNA水平 (qPCR)：通常在转染后24-48小时。 •检测荧光蛋白 (显微镜)：通常在转染后24小时即可观察到，48小时更强。 •进行药物筛选或功能实验：根据实验设计确定时间点。

四、影响换液时间的特殊情况与优化策略

虽然4-6小时是标准时间，但在实际操作中，你可能需要根据具体情况进行微调。

1. 细胞类型和状态 (Cell Type & Health):
   • 敏感/娇贵细胞(如原代细胞、干细胞、某些神经细胞)：这些细胞对Lipo2000的毒性更敏感。建议严格遵守4小时换液，甚至可以尝试更短的时间（如3小时），并密切观察细胞状态。
   • 皮实/耐受细胞(如HEK293T, HeLa, CHO)：这些细胞系比较耐受，即使孵育超过6小时（例如8小时甚至过夜）也可能有不错的存活率。有些实验室为了方便，会选择孵育过夜后第二天早上再换液，但这通常会牺牲一部分细胞活性来换取操作便利，不推荐作为首选方案。
2. 转染的核酸类型 (Nucleic Acid Type):
   • 质粒DNA (Plasmid DNA)：需要进入细胞核进行转录和翻译，过程较慢，4-6小时的孵育是比较理想的。
   • siRNA / miRNA：主要在细胞质中发挥作用，过程相对较快。4-6小时的窗口同样适用，但对时间的依赖性可能没有质粒那么强。
3. 实验目的 (Experimental Goal):
   • 追求最高转染效率：可以在4-6小时之间进行摸索，找到对你的细胞系最优点。
   • 追求最高细胞活性：如果你后续需要进行精细的功能实验（如电生理、细胞迁移等），那么应优先保证细胞状态，建议选择较短的孵育时间（如4小时），并温柔操作。

总结与最佳实践 (Summary & Best Practices)

• 标准起点：从4-6小时开始你的实验。
• 温柔操作：换液和清洗时，动作务必轻柔，避免细胞脱落。
• 培养基预热：所有接触细胞的液体（PBS、培养基）都应预热到37°C。
• 进行预实验：如果你使用的是新的细胞系或对结果要求极高，强烈建议进行一次预实验，可以设置3h, 4h, 5h, 6h几个时间梯度，结合转染效率（如GFP阳性率）和细胞死亡情况（如台盼蓝染色），找到最适合你实验体系的“黄金时间点”。